检测方法：竞争法 ELISA（Competitive ELISA）

适用样本：血清、血浆、尿液、组织匀浆液、细胞裂解液等

试剂盒组成

| 组分 | 体积/数量 | 保存条件 |

| 预包被AQP-2抗体的微孔板 | 96孔板（12条x8孔） | 4℃（干燥） |

| 大鼠AQP-2标准品 | 2管（冻干粉） | -20℃（复溶后4℃）|

| 样本稀释缓冲液 | 20mL | 4℃ |

| 辣根过氧化物酶标记物 | 6mL | 4℃（避光） |

| TMB底物溶液 | 10mL | 4℃（避光） |

| 终止液（2M H₂SO₄） | 10mL | 4℃ |

| 洗涤液（20X浓缩） | 30mL | 4℃ |

| 封板膜 | 3张 | 室温 |

检测原理

竞争结合反应：样本中的AQP-2与固定于孔板的抗体竞争结合HRP标记的酶标物。

酶促显色：未结合的酶标物被洗去后，加入TMB底物产生蓝色反应。

信号终止：加入硫酸终止液后颜色转为黄色。

吸光度测定：在450nm波长读取OD值，计算AQP-2浓度。

样本前处理

| 样本类型 | 处理方式 | 推荐稀释度 | 保存条件 |

| 血清/血浆 | 3000rpm离心15分钟，避免溶血/脂血 | 1:5~1:10 | -20℃ |

| 尿液 | 直接检测或适当稀释 | ≤1:2 | -20℃ |

| 肾组织匀浆 | PBS匀浆→离心取上清→调整蛋白浓度至1-2mg/mL | 1:10~1:20 | -20℃ |

标准曲线范围

0.312~20ng/mL

标准品梯度：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL（复溶后稀释）。

关键性能参数

| 指标 | 参数 |

| 灵敏度 | 0.156 ng/mL（最小检测限）|

| 检测时间 | 2小时（37℃孵育） |

| 精密度 | 批内变异<10%，批间<15%|

| 回收率 | 85~115% |

| 交叉反应 | 与大鼠AQP-1/AQP-3无显著交叉 |

操作步骤

准备试剂：复溶标准品，配制洗涤液（1X）。

加样：

孔1-7：标准品梯度（100μL）

测试孔：样本（50μL）+稀释缓冲液（50μL）

空白孔：仅加稀释缓冲液

加酶标物：每孔加50μL酶标记物（空白孔除外）。

孵育：37℃避光孵育60分钟。

洗涤：洗板5次（每孔300μL 1X洗涤液）。

显色：每孔加90μL TMB底物→室温避光20分钟。

终止：每孔加50μL终止液（蓝色→黄色）。

读值：5分钟内测定OD450nm（建议630nm参比波长）。

结果计算

计算标准曲线：以标准品浓度（X）与OD值（Y）作Logistic回归曲线。

样本浓度：根据样本OD值从曲线计算浓度，乘以稀释倍数。

注意事项

复溶标准品：用1mL去离子水溶解后静置15分钟，分装冻存（复溶后1周内用完）。

洗涤充分：洗板后拍干微孔板（避免残留液体影响结果）。

避光保护：酶标物及TMB在操作时需避光。

终止操作：强酸终止液需戴手套操作，避免接触皮肤。

线性范围：超出20ng/mL的样本需进一步稀释后复测。

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