大鼠碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒

检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法：

预包被抗大鼠ALP抗体于微孔板中；

加入样本或标准品，ALP与包被抗体结合；

加入生物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-检测抗体”复合物；

加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，与生物素结合；

加入显色底物TMB，HRP催化TMB显蓝色；

终止液终止反应，蓝色转为黄色，在450nm波长测定吸光度（OD值），ALP浓度与OD值成正比。

检测方法：双抗体夹心酶联免疫吸附法（Sandwich ELISA）

适用样本：血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液等

保存条件：2-8℃避光保存（未开封），有效期12个月

试剂盒组成

| 组分 | 96T规格 | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 96孔×1块 | 2-8℃ |

| 标准品（重组大鼠ALP）| 冻干粉×2支 | -20℃ |

| 标准品稀释液 | 10mL×1瓶 | 2-8℃ |

| 样本稀释液 | 20mL×1瓶 | 2-8℃ |

| 生物素标记检测抗体 | 120μL×1瓶 | -20℃ |

| HRP标记链霉亲和素 | 120μL×1瓶 | -20℃（避光）|

| TMB显色液 | 10mL×1瓶 | 2-8℃（避光）|

| 终止液（2M H₂SO₄） | 10mL×1瓶 | 2-8℃ |

| 洗涤液（20×浓缩） | 30mL×1瓶 | 2-8℃ |

样本处理

血清/血浆：采集后离心去除杂质，-20℃分装保存，避免反复冻融。

组织匀浆：取组织用PBS匀浆，离心取上清。

细胞上清：离心去除沉淀后直接检测。

注：样本需稀释（建议1:10~1:100），用样本稀释液调整至检测范围内。

标准曲线范围

0.312 ng/mL → 20 ng/mL

标准品梯度：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL（0为空白对照）

操作步骤

标准品复溶：用1mL标准品稀释液溶解冻干粉，静置15分钟后混匀。

加样：

标准品孔：50μL/孔（梯度浓度）

样本孔：50μL/孔（已稀释样本）

空白对照：50μL样本稀释液

孵育：37℃孵育30分钟，洗板5次。

加检测抗体：每孔加50μL生物素标记抗体，37℃孵育30分钟，洗板5次。

加酶结合物：每孔加100μL HRP-链霉亲和素，37℃避光孵育10分钟，洗板5次。

显色：每孔加90μL TMB，37℃避光显色15分钟（显蓝色）。

终止：每孔加50μL终止液（蓝色转黄色）。

检测：5分钟内在450nm波长读取OD值（参考波长630nm）。

结果计算

计算标准品/样本平均OD值（减去空白孔OD值）。

以标准品浓度为横坐标（log值），OD值为纵坐标，绘制标准曲线（四参数拟合）。

根据样本OD值从曲线方程计算浓度，乘以稀释倍数即为实际浓度。

性能参数

灵敏度：0.156 ng/mL

精密度：板内变异系数（CV）< 8%，板间CV < 10%

回收率：85%-115%

特异性：不与大鼠其他磷酸酶（如ACP）交叉反应

注意事项

试剂使用前平衡至室温（20-25℃）。

洗涤液需用蒸馏水1:20稀释。

TMB对光敏感，避免长时间暴露。

终止液为强酸，避免接触皮肤。

样本中ALP浓度过高时需进一步稀释。

超出标准曲线范围的样本需重新检测。
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