检测原理

采用双抗体夹心法：

预包被抗人α-淀粉酶单克隆抗体于微孔板

加入样本/标准品，α-淀粉酶与捕获抗体结合

加入生物素标记的检测抗体，形成夹心复合物

加入辣根过氧化物酶（HRP）标记链霉亲和素

加入TMB显色底物，酶催化产生蓝色产物

终止液（H₂SO₄）终止反应，黄色（450nm读数）

样本类型与处理

适用样本：血清、血浆（肝素/EDTA抗凝）、尿液、细胞上清液

处理要求：

血清/血浆：4℃ 3000×g离心10分钟，避免反复冻融

尿液：需稀释100倍后检测

储存：-20℃冻存（避免反复冻融）

试剂盒组成

| 组分 | 体积/数量 | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 96孔 | 2–8°C干燥保存 |

| α-淀粉酶标准品（400 U/L） | 0.5mL × 2支 | -20°C |

| 样本稀释液 | 30mL | 2–8°C |

| 生物素标记检测抗体 | 1.2mL | -20°C |

| HRP标记链霉亲和素 | 1.2mL | -20°C |

| TMB显色液 | 15mL | 避光 2–8°C |

| 终止液（2M H₂SO₄） | 10mL | 2–8°C |

| 洗涤液（30×浓缩液） | 50mL | 2–8°C |

5. 所需器材（不包含）

酶标仪（450nm主波长，620nm参考波长）

37℃恒温孵育箱

自动洗板机/手动洗瓶

微量移液器（10μL, 100μL, 1000μL）

去离子水

操作步骤

注：使用前所有试剂平衡至室温（25℃）

标准品稀释：用样本稀释液将400 U/L标准品梯度稀释为：0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 U/L

加样：每孔加入标准品/待测样本各100μL（尿液需按1:100预稀释），空白孔仅加稀释液

孵育：37℃避光孵育1小时

洗板：弃液 → PBS-T（1×洗涤液）洗5次 → 拍干

加检测抗体：每孔加生物素抗体50μL → 37℃孵育45分钟

洗板：同步骤4

加酶结合物：每孔加HRP-链霉亲和素100μL → 37℃避光孵育30分钟

洗板：同步骤4

显色：每孔加TMB底物100μL → 37℃避光反应15分钟（蓝色）

终止：每孔加终止液100μL → 蓝色转黄色

读数：30分钟内450nm测OD值，参考波长620nm

结果计算

计算标准孔平均OD值 → 绘制标准曲线（四参数对数拟合/线性回归）

样本浓度 = （样本OD值 – 空白OD值）对应标准曲线计算值（U/L）

尿液样本浓度需 × 稀释倍数（100）

性能参数

| 指标 | 数值 |

| 检测范围 | 5–400 U/L |

| 灵敏度 | 1.5 U/L（最低检测限） |

| 精密度 | 批内CV < 8% ; 批间CV < 12% |

| 回收率 | 85–115%（血清样本） |

| 特异性 | 与人唾液淀粉酶交叉性<0.1% |

| 线性范围 | r² ≥ 0.990（稀释验证）|

参考区间

血清/血浆：28–100 U/L

尿液： < 460 U/L（24小时尿）

注：各实验室应建立本地参考值

注意事项

终止液含酸，需防护操作！

TMB避光保存，显色后若孔内变绿说明污染，数据作废

不同批次试剂不可混用

尿液样本需做稀释验证（线性偏差≤15%）

高于400 U/L样本需用稀释液稀释后复测

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