检测方法：双抗体夹心酶联免疫吸附法（Sandwich ELISA）

检测样本：血清、血浆、细胞培养上清液、组织裂解液

灵敏度：≤1.0 pg/mL

检测范围：3.9 pg/mL - 250 pg/mL

储存条件：2-8°C避光保存（未开封）

有效期：12个月

检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法：

抗人CD14单克隆抗体预包被于96孔板；

样本/标准品中的CD14与包被抗体结合；

加入生物素标记的抗人CD14二抗，形成“抗体-抗原-二抗”复合物；

添加链霉素亲和素-HRP（辣根过氧化物酶）偶联物；

加入TMB底物显色，终止后测量450nm吸光度（OD值）。

试剂盒组分

| 组分 | 规格（96孔） | 保存条件 |

| 预包被CD14抗体微孔板 | 96孔×1板 | 2-8°C |

| CD14标准品（冻干） | 2支（50ng/支）| -20°C |

| 生物素标记检测抗体 | 1.2 mL | 2-8°C |

| 链霉亲和素-HRP | 6 mL | 2-8°C |

| TMB底物液 | 10 mL | 2-8°C避光|

| 终止液（2M H₂SO₄） | 10 mL | 室温 |

| 洗涤缓冲液（25×浓缩） | 30 mL | 2-8°C |

| 样本稀释液 | 20 mL | 2-8°C |

样本处理指南

| 样本类型 | 预处理要求 |

| 血清/血浆 | 离心去除杂质（推荐3000 rpm × 10 min），-80°C分装冻存，避免反复冻融。 |

| 细胞上清 | 离心去除细胞碎片（2000 rpm × 5 min），立即检测或-20°C保存。 |

| 组织匀浆 | 按1g组织加1mL PBS匀浆，离心取上清（10000 rpm × 10 min），-80°C保存。 |

注：建议样本稀释后检测（推荐起始稀释倍数：血清/血浆×10，细胞上清×2）。

操作步骤

标准品稀释：用样本稀释液将冻干标准品梯度稀释为0-250 pg/mL的7个浓度。

加样：每孔加入100μL样本或标准品，37°C孵育90分钟。

洗涤：弃液后用1×洗涤缓冲液洗板4次（每孔300μL）。

加检测抗体：每孔加100μL生物素标记抗体，37°C孵育60分钟。

加酶偶联物：洗板后加100μL链霉亲和素-HRP，37°C孵育30分钟。

显色：洗板后加90μL TMB底物，避光室温显色15分钟。

终止：加50μL终止液，5分钟内测量450nm OD值。

结果计算

绘制标准曲线：以标准品浓度（log）为横坐标，OD值为纵坐标；

拟合四参数曲线（4PL），计算样本浓度；

稀释样本需乘以稀释倍数。

典型标准曲线参考：

| 浓度 (pg/mL) | OD450值 (均值) |

| 0 | 0.05 |

| 3.9 | 0.12 |

| 15.6 | 0.35 |

| 62.5 | 0.89 |

| 125 | 1.45 |

| 250 | 1.95 |

注意事项

所有试剂使用前平衡至室温（20-25°C）；

洗涤时彻底拍干微孔板，避免交叉污染；

TMB对光敏感，显色时间需严格控制；

高脂血症或溶血样本可能干扰结果；

弃液需按生物危害废物处理；

超出检测范围样本需稀释复测。

技术参数

精密度：板内变异系数（CV）<8%，板间CV<12%；

回收率：血清样本80%-115%；

特异性：不与sCD16、TLR4等其他炎症因子交叉反应；

干扰：20mg/dL胆红素或5mg/dL血红蛋白无显著干扰。

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