大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒

预期用途

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 (Sandwich ELISA)，用于定量检测大鼠血清、血浆、细胞培养上清液或组织匀浆液等样本中的高迁移率族蛋白B1 (HMGB-1) 浓度。

检测原理

预包被： 微孔板孔内预先包被有抗大鼠 HMGB-1 的特异性捕获抗体。

样本/标准品加入： 将待测样本或已知浓度的 HMGB-1 标准品加入孔中。样本中的 HMGB-1 会被捕获抗体结合。

洗涤： 洗去未结合的物质。

生物素化检测抗体加入： 加入生物素标记的抗大鼠 HMGB-1 检测抗体，该抗体与已被捕获的 HMGB-1 的不同表位结合，形成“捕获抗体-HMGB1-检测抗体”复合物。

洗涤： 再次洗去未结合的生物素化检测抗体。

辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 (HRP-Streptavidin) 加入： HRP-Streptavidin 会与生物素特异性结合。

洗涤： 洗去未结合的 HRP-Streptavidin。

底物 (TMB) 加入： 加入显色底物 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)。在 HRP 的催化下，TMB 转化为蓝色产物。

终止反应： 加入终止液 (通常是酸性溶液)，使反应停止，蓝色转变为黄色。

吸光度测定： 在酶标仪上于 450 nm 波长 (参考波长通常为 630 nm 或 570 nm) 测定各孔的吸光度值 (OD 值)。

定量分析： 标准品浓度与对应的 OD 值绘制标准曲线。根据样本的 OD 值，通过标准曲线即可计算出样本中 HMGB-1 的浓度。

操作步骤

试剂准备

平衡：所有组分使用前需室温平衡20-30分钟。

标准品：按说明书梯度稀释（通常为0-500 pg/mL）。

加样与孵育

标准品孔：加入50μL不同浓度标准品。

样本孔：加入10μL待测样本+40μL稀释液（或直接加50μL，依说明书调整）。

空白孔：仅加样本稀释液。

每孔加入HRP标记抗体100μL，37℃孵育60分钟。

洗涤

弃液后拍干，每孔加满洗涤液（PBS+0.05% Tween-20），重复洗板5次。

显色与终止

加底物A/B各50μL，避光孵育15分钟。

加入终止液50μL，颜色由蓝变黄。

检测

15分钟内于450nm读取OD值（校正波长630nm）。

数据分析

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

样本浓度通过曲线方程计算，复孔CV值应＜10%。

注意事项

样本处理：血清/血浆需离心去除杂质，避免溶血；细胞培养上清需去除沉淀。

实验控制：建议设置复孔，标准曲线R²≥0.99。

干扰因素：避免反复冻融样本，高脂血症样本可能需额外处理。

安全防护：终止液含硫酸，需佩戴手套操作。
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