大鼠维生素K1(VK1)ELISA试剂盒

试剂盒原理

本试剂盒采用**竞争法酶联免疫吸附试验(Competitive ELISA)**原理定量检测大鼠样本中的维生素K1 (VK1)。

包被： 在微孔板上预包被抗-VK1特异性抗体。

竞争结合： 同时加入待测样本(或标准品)中的游离VK1和定量加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记VK1 (VK1-HRP Conjugate)。

孵育： 样本中的游离VK1和VK1-HRP Conjugate竞争性地结合包被在孔板上的有限抗体位点。样本中VK1浓度越高，能结合到孔板上的VK1-HRP Conjugate就越少。

洗涤： 洗去未结合的物质。

显色： 加入显色底物溶液(TMB或其他)，VK1-HRP Conjugate催化底物反应产生蓝色产物。

终止反应： 加入终止液使反应停止，蓝色转变为黄色。

吸光度检测： 在特定波长(通常450nm)下检测各孔的光密度(OD值)。

定量： 未知样本中的VK1浓度通过比较其OD值与已知浓度的标准品OD值绘制出的标准曲线来确定。浓度越高，OD值越低。

实验操作流程

准备试剂：

取出试剂盒，室温平衡30分钟(具体时间按说明书)。

稀释浓缩洗涤液：1份浓缩液加入19份(20X)或29份(30X)去离子水，混匀备用。

配制标准品：用复溶缓冲液(如无水乙醇或含乙醇缓冲液)溶解冻干标准品，涡旋混匀，然后用样本稀释液梯度稀释成所需浓度(如0, 30, 100, 300, 1000, 2000 pg/mL)。标准品浓度至关重要！

稀释酶标结合物：用酶标结合物稀释液按说明书比例稀释VK1-HRP。现用现配。

(如需)样本处理：血清血浆可直接检测或适当稀释；组织匀浆/细胞裂解液通常需要离心取上清并适当稀释(根据预实验确定稀释倍数)。脂溶性维生素样本需特别注意：血清/血浆可能需要脂蛋白沉淀或脱脂处理。组织(如肝)需精密称重，加PBS或裂解缓冲液匀浆后离心取上清液。样本应尽可能新鲜，-20°C或-80°C短期保存，避免反复冻融。

加样孵育：

设置微孔板：标准品孔 (0, S1-S5/S6)，空白孔 (Blank, 只加试剂不加样本)，样本孔，质控孔。

标准品孔：加入不同浓度的标准品溶液100μL。

空白孔：加入样本稀释液100μL。

样本孔：加入经适当稀释的待测样本100μL。

酶标结合物孔：除空白孔外，每孔立即加入稀释好的酶标结合物50μL。轻轻晃动混匀 (避免产生气泡)。

使用封板膜密封板孔，37°C恒温避光孵育 60分钟 (时间温度严格按说明书)。

洗涤：

弃去孔内

结果计算

计算平均OD值： 计算标准品各浓度点和样本重复孔的OD平均值。

空白校正： 样本OD值 (和标准品OD值) 减去空白孔OD值 (若空白值高需注意)。

绘制标准曲线：

以标准品浓度的对数为横坐标(X-axis)，以相应的空白校正后的OD值(B)与零浓度标准品(0 pg/mL)空白校正后的OD值(B0)的百分比(B/B0%)为纵坐标(Y-axis)。

B/B0% = (标准品OD / S0 的 OD) × 100%

使用合适的曲线拟合软件(如四参数逻辑回归4PL, 线性对数, logit-log)拟合出**标准曲线方程 (4PL是最常用且最推荐的拟合模型)。

计算样本浓度：

将样本的B/B0%值代入标准曲线方程，即可求得对应的浓度值X。

乘以样本稀释倍数(Dilution Factor)，即得到样本中的实际VK1浓度 (如 pg/mL 血清/血浆, pg/mg组织等)。

浓度低于LOQ报告为小于LOQ，高于最高标准品报告为高于ULOQ，需适当稀释后重测。

应用范围

大鼠维生素K1营养状态研究

维生素K1代谢相关疾病模型研究

药物或膳食成分对维生素K1吸收与代谢的影响

相关基因功能研究(如γ-羧化酶相关)
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