检测原理

本试剂盒采用特异性抗25-OH-D2抗体预包被微孔板。样本/标准品中的25-OH-D2与辣根过氧化物酶（HRP）标记的25-OH-D2竞争结合抗体。经洗涤后，加入显色底物（TMB），蓝色显色强度与样本中25-OH-D2浓度成反比。终止反应后，在450nm波长测定吸光度（OD值），通过标准曲线定量。

试剂盒组分

| 组分 | 规格 | 保存条件 |

| 预包被抗体微孔板 | 96孔（12条×8孔） | 2-8℃（干燥） |

| 25-OH-D2标准品 (0 ng/mL) | 1管 x 1.2mL | -20℃ |

| 标准品稀释液 | 1瓶 x 15mL | 2-8℃ |

| HRP标记25-OH-D2 | 1管 x 200µL | -20℃ (避光) |

| 样品稀释液 | 1瓶 x 30mL | 2-8℃ |

| 浓缩洗涤液 (20X) | 1瓶 x 50mL | 室温 |

| TMB显色液 | 1瓶 x 12mL | 2-8℃ (避光) |

| 终止液 (2M H₂SO₄) | 1瓶 x 15mL | 室温 |

| 封板膜 | 4张 | 室温 |

样本要求

样本类型：血清、EDTA/肝素抗凝血浆（推荐）

制备：取血后室温静置30分钟→2000×g离心15分钟→立即分离血清/血浆→-80℃冻存（避免反复冻融）

稀释：用样品稀释液按 1:10 稀释样本（100µL样本 + 900µL稀释液）

标准曲线范围

0.15, 0.5, 1, 2, 5, 10, 30, 60, 100 ng/mL

（使用高精度移液器梯度稀释标准品）

操作步骤

准备试剂：复融标准品、恢复微孔板至室温（20-25℃），配制工作洗涤液（1X）

加样（各孔50µL）：

标准品孔：各浓度标准品

样本孔：稀释后样本

空白孔：样品稀释液

加酶标物：每孔加入 50µL HRP-25OHD2（除空白孔）

孵育：37℃避光孵育 60分钟

洗涤：用洗板机/手动洗板5次（拍干）

显色：每孔加 100µL TMB → 37℃避光 15分钟

终止：每孔加 50µL 终止液（蓝色→黄色）

读值：5分钟内于 450nm 检测OD值（参考波长630nm）

结果计算

计算 标准品/样本平均OD值（扣除空白孔）

以标准品浓度为X轴，B/B0（样品OD / 0标准品OD）为Y轴

使用四参数拟合（4PL）生成标准曲线（推荐使用SoftMax Pro/GraphPad软件）

代入样本的B/B0值计算浓度，最终浓度 = 曲线值 × 稀释倍数 (10)

技术参数

| 参数 | 性能指标 |

| 检测范围 | 0.15 - 100 ng/mL |

| 灵敏度 | 最低检测限 (LOD): 0.08 ng/mL |

| 精密度 | 批内CV < 8%，批间CV < 12% |

| 特异性 | 25-OH-D2: 100% |

| | 25-OH-D3: < 0.1% |

| | 维生素D2/D3: 无交叉反应 |

| 回收率 | 85%-115% (血清添加实验) |

| 稳定性 | 未开封试剂盒：12个月（2-8℃） |

注意事项

重要提示：

不同种属间抗体存在差异，禁用于人、小鼠等其他物种

避免接触氧化剂、金属离子（影响显色）

若OD值超出标准曲线范围，需调整样本稀释倍数重测

实验室需符合Biosafety Level 1 (BSL-1) 标准

公司正在出售的产品