检测原理

本试剂盒采用竞争性酶联免疫吸附法(Competitive ELISA)：

预包被抗大鼠25(OH)D抗体的微孔板。

样本/标准品中的25(OH)D与生物素标记的25(OH)D共同竞争结合抗体。

加入链霉亲和素-HRP，与生物素结合。

加入TMB显色底物，颜色深浅与样本中25(OH)D浓度成反比。

450nm波长下测定吸光度(OD)，通过标准曲线计算浓度。

试剂盒组成

| 组分 | 规格 | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 96孔 (可拆卸) | 2-8℃ |

| 25(OH)D标准品 | 6-8浓度梯度 (0-120 ng/mL) | -20℃冷冻 |

| 生物素标记25(OH)D | 1瓶 | -20℃ |

| 链霉亲和素-HRP | 1瓶 | -20℃ |

| 样本稀释液 | 1瓶 | 2-8℃ |

| 20×浓缩洗涤液 | 1瓶 | 室温 |

| TMB显色液A/B | 各1瓶 | 2-8℃避光 |

| 终止液 (2M H₂SO₄) | 1瓶 | 室温 |

| 封板膜 | 3张 | 室温 |

样本前处理

血清/血浆采集：空腹采血，室温凝固30分钟后离心 (1000×g, 15min)，取上清分装。

保存：

→ 短期 (1周内)：2-8℃冷藏

→ 长期：-20℃或-80℃冷冻 (避免反复冻融)

稀释：部分试剂盒需要1:10~1:20稀释样本 (参照说明书)

灵敏度与检测范围

| 参数 | 数值 |

|------|------|

| 最低检测限(LOD) | 0.5-2 ng/mL |

| 线性范围 | 2~80 ng/mL (或0-120 ng/mL) |

| 检测时长 | 约2.5小时 |

操作流程

graph TD

    A[将标准品/样本加入预包被孔] --> B[加入生物素标记物]

    B --> C[37℃孵育60min]

    C --> D[洗板5次]

    D --> E[加入SA-HRP溶液]

    E --> F[37℃孵育30min]

    F --> G[洗板5次]

    G --> H[加入TMB避光显色15min]

    H --> I[加入终止液]

    I --> J[450nm测定OD值]

结果计算

绘制标准曲线：以标准品浓度(X) vs. B/B₀% (Y) 拟合4参数逻辑曲线

B = 标准品/样本OD值

B₀ = 0标准品OD值

根据样本OD值从曲线计算浓度

若样本被稀释，需乘以稀释倍数

注意事项

避免溶血：血红蛋白>0.5g/L会导致假阳性

控制室温：所有试剂平衡至25℃再使用

精确计时：显色时间误差需<30秒

离心速度：分离血浆需≥1000×g，避免血小板污染

解冻方式：样本需缓慢解冻（4℃过夜），避免反复冻融

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