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莽草酸脱氢酶(SD)测试盒(微量法)
货号:SD-1-Y
包装:100管/96样


产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径,莽草酸脱氢酶是莽草酸合成途径中的关键酶。

测定原理:

莽草酸脱氢酶催化莽草酸和 NADP产生 NADPH,检测 340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 25mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)在试剂二中加入 10mL试剂一充分溶解混匀,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min,现配现用。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本和 190μL试剂二,混匀,立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 5min20s后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

SD活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4  L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103  L/  mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4  L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103  L/  mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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