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鸟氨酸转氨酶(OAT)测试盒(紫外分光光度法)
货号:OAT-2-Y
包装:50管/48样


产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu)和鸟氨酸( Orn)两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT)是是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同时产生 NAD,通过检测 340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外可见分光光度计、1mL石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液:液体 55mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体 70 mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加 20mL试剂一充分溶解;用不完的试剂 4℃保存。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加 20mL试剂一充分溶解;用不完的试剂 4℃保存。

试剂四:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加 10mL试剂一充分溶解;现配现用。

酶液提取

1.组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g离心 10min,取上清置冰上待测。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 4℃,10000g离心 10min,取上清置冰上待测。

3.液体:直接检测。

测定操作

1.分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm。

2.将配好的试剂二、三、四 37℃预热 5min。(注意:粉剂试剂需要自行配制)

3.取 1mL石英比色皿,依次加入 300μL试剂二,300μL试剂三,300μL试剂四,100μL粗酶液,充分混匀,记录 340nm处初始吸光值和 37℃反应 10min的吸光值 A2,△A=A1-A2。

计算公式

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=160.77×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/g鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=160.77×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=160.77×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(nmol/min/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=160.77×ΔA

V反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

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