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转氢酶-2活性检测试剂盒(100T)
货号:AK257
包装:100T/96S


产品名称
Transhydrogenase-2 Assay Kit(100T)
产品介绍

意义:线粒体转氢酶-2 (Mitochondrial hydrogenase-2, TH-2) 位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化 NADH+ NADP+ 和 NAD++ NADPH 相互转化,调节线粒体 NAD(H) 和 NADP(H) 平衡。 把逆向反应称为 TH-2,催化 NADPH 和 NAD+ 生成 NADP+ 和 NADH。

原理:NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收,因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代 NAD+,TH-2 催化 APAD+ 还原生成 APADH,APADH 在 375nm 有特征光吸收,测定 375nm 光吸收的增加速率,来计算 TH-2 活性。

检测方法:微量法

产品组成及保存条件:

编号

规格

储存条件

AK257-A

100 mL×1 瓶

-20℃保存;

AK257-B

50 mL×1 瓶

-20℃保存;

AK257-C

18 mL×1 瓶

4℃保存。

AK257-D

粉剂×1 支

-20℃保存;

AK257-E

粉剂×1 支

-20℃保存;

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样品的制备:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离

1. 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL AK257-A,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆液 600g,4℃离心 5min。

3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)。

5. 步骤 4 中的沉淀即为线粒体,加入 500uL AK257-B,超声波破碎(冰浴,功率 20% 或 200W, 超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 TH-2 活性测定。

测定步骤:

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 375 nm,蒸馏水调零。

2. 工作液的配制:临用前将 AK257-D, E 转移到 AK257-C 中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或

25℃(其它物种)水浴 5min,现配现用;

3. 在 微量石英比色皿或 96 孔板中按顺序加入下列试剂

试剂名称

测定管 (μL)

样品

20

工作液

180

混匀,立即记录 375 nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

TH-2 含量计算公式:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 74.5×ΔA÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T = 149×ΔA÷Cpr

※ 蛋白定量检测建议使用本公司:BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min /104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T = 0.149×ΔA

注: V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADH 摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比 色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时 间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 149×ΔA÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T = 298×ΔA÷Cpr

※ 蛋白定量检测建议使用本公司:BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔA

注: V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADH 摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T: 反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

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