大鼠c-jun ELISA试剂盒

检测原理

本试剂盒基于双抗体夹心法原理：

将针对大鼠 c-jun 的特异性捕获抗体预包被在微孔板上。

加入标准品或待测样本，样本中的 c-jun 蛋白被捕获抗体结合并固定。

加入生物素标记的抗大鼠 c-jun 检测抗体，形成“捕获抗体-c-jun-检测抗体”复合物。

加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

加入显色底物 TMB。

加入终止液终止反应。

立即用酶标仪在 450 nm 波长下测量各孔吸光度值。

标准品的吸光度值绘制标准曲线，待测样本浓度根据其吸光度值在标准曲线上计算得出。

样本收集与保存

血清： 室温血液自然凝固30分钟，4°C 1000-2000g离心20分钟。取上清，尽快检测。短期可2-8°C保存，长期需分装于-20°C或-80°C保存，避免反复冻融。

血浆： 使用EDTA、肝素或柠檬酸钠作为抗凝剂收集。离心时间同上。储存要求同血清。

组织匀浆： 取适量组织，加入预冷的PBS或裂解缓冲液，冰上机械匀浆。匀浆液4°C 3000-5000g离心15-20分钟，取上清检测或储存(-20°C或-80°C)。

细胞裂解液： 细胞用预冷的PBS洗涤，加入裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）。冰上裂解一定时间后，离心取上清。

检测前确保样本澄清无颗粒。如有必要可再次离心或稀释。

剧烈溶血或脂血样本可能干扰检测结果。

实验前准备

取出试剂盒各组分平衡至室温 (约30分钟)。除预包被板外，其他液体试剂使用前需轻轻混匀。

配制工作液：

洗涤缓冲液： 按说明书要求用蒸馏水将浓缩洗涤液（如20X）稀释成1X工作液。

标准品： 如需复溶或稀释冻干粉，按说明用提供的稀释液操作，制备成系列浓度。通常建议用微量离心管连续稀释。

检测抗体： 按说明书比例用检测抗体稀释液稀释生物素标记的抗体。

链霉亲和素-HRP： 按说明书比例用链霉亲和素-HRP稀释液稀释。

样本准备： 将需要检测的样本按预期稀释倍数用样本稀释液进行稀释。(重要：具体稀释倍数请参考该试剂盒说明书，通常需要进行预实验确定)。

操作步骤

设置标准孔、样本孔、空白孔（加样本稀释液）。标准孔每个浓度建议做复孔或三复孔。

每孔加入相应的标准品或稀释好的样本。盖板膜。

温育： 37°C孵育1-2小时。

弃液体，拍干。

洗涤： 每孔加满1X洗涤缓冲液，静置30-60秒，弃液拍干。重复洗板4-5次。

每孔加入配制好的生物素标记检测抗体。

温育： 37°C孵育60分钟。

洗板5次 (同上)。

每孔加入配制好的链霉亲和素-HRP工作液。

温育： 37°C避光孵育30分钟。

洗板5次 (同上)。

每孔加入显色底物TMB溶液。

温育： 37°C避光显色15-30分钟 (观察颜色变化，显色过深会影响结果)。

每孔加入终止液（50μL TMB加50μL终止液是常见配置）。

读板： 立即在450 nm波长下测量OD值 (参考波长630 nm用于双波长校正去除孔板底物干扰)。

结果计算

计算每个标准点和样本孔的平均OD值（减去空白孔平均值）。

以标准品浓度为横坐标 (X轴)，平均OD值为纵坐标 (Y轴)，在坐标纸上绘制标准曲线或使用曲线拟合软件（4-参数/Logistic曲线拟合法效果通常较好）拟合标准曲线方程。
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