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滤纸酶检测试剂盒(可见分光光度法)
包装:50管/24样


产品介绍

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖一类酶的总称,它不是单体酶,而是起协同作用的多组分酶系。以不溶性纤维素如滤纸为底物测定的纤维素酶称为滤纸酶,研究滤纸酶活力对纤维素酶总体酶活力的研究的有着重要意义。

FPA水解滤纸产生还原糖,还原糖与3,5 -二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质,通过测定540nm处吸光值变化可计算得FPA活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
试剂一液体35ml×1瓶2-8℃
试剂二液体60ml×1瓶2-8℃
滤纸条50mg×50条室温
标准品粉剂×1瓶2-8℃

溶液的配制:

1.滤纸条:常温防潮保存。

2.标准品:临用前加入1ml蒸馏水溶解,配成10mg/ml葡萄糖溶液备用,4℃可保存一周。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1ml玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管(2ml)

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献):

1.组织:按照质量(g):蒸馏水体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1ml蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于4℃,12000rpm离心10min,取上清置于冰上待测。

2.细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管中,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104个)﹕蒸馏水体积(ml)为500~1000﹕1的比例(建议500万细胞或细菌加入1ml蒸馏水),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率300 w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,12000 rpm离心10min,取上清置于冰上待测。

3.培养液或其它液体:直接检测。

二、测定操作:

1.分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。

2.将10mg/ml标准液用蒸馏水稀释为0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2mg/ml的标准溶液备用。

3.取200 μL样本沸水浴10min(盖紧,防止水分散失),放置常温后作为对照管。

4.操作表:(在2ml离心管中操作,其中对照管与测定管用有滤纸的EP管,空白管与标准管无需滤纸)

试剂名称(μL)对照管测定管标准管空白管
煮沸样本200---
样本-200--
每支Ep管中放入一个卷状滤纸条(注意要放入底部),作为底物。
标准溶液--200-
蒸馏水---200
试剂一500500500500
混匀,50℃水浴锅中准确反应30min
试剂二800800800800
混匀,沸水浴5min(盖紧,防止水分散失),取出后立即冷却至室温,测定540nm处吸光值A,分别记为A对照管、A测定管、A标准管、A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管,标准曲线只需检测1-2次。

三、FPA活性计算

1.标准曲线的绘制:以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程

y=kx+b,将ΔA带入方程得到x(mg/ml)。

2. FPA活性的计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活定义:每mg蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/mg prot)=x×V提取÷(V提取×Cpr)÷T=0.0333x÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活定义:每g样品每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/g质量)=x×V提取÷W÷T=0.0333x÷W

(3)按照细胞或细菌数量计算

酶活定义:每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/104 cell)=x×V提取÷细胞数量(万个)÷T=0.0333x÷细胞数量(万个)

(4)按液体体积计算

酶活定义:每ml样本每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/ml)= x×V样÷V样÷T =0.0333x

V提取:提取液(蒸馏水)体积,1ml;V样:加入的样本体积,0.2ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,30min。

注意事项:

1.用干净的镊子取出滤纸条,带手套将滤纸条卷成小卷放入Ep管底部。

2.当A或ΔA超过1.2时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色结束吸取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条,以免带入毛状物,影响测定结果。

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