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肌酸激酶活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK) (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶,主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中,能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应,是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。

CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP,己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADpH,导致340nm光吸收值增加,以此来表示CK酶活。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体110ml×1瓶2-8℃
试剂一粉剂×1瓶-20℃
试剂二粉剂×1支-20℃
试剂三粉剂×1支-20℃
试剂四粉剂×1支-20℃
试剂五液体5ml×1瓶2-8℃

溶液的配制:

1.试剂一:临用前加5ml蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

2.试剂二:临用前加入0.5ml蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

3.试剂三:临用前加入0.5ml蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

4.试剂四:临用前加入0.65ml蒸馏水溶解;用不完的分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

5.工作液:临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以70:4:7:10:90的比例混合(体积比)。现用现配。使用前室温孵育20min(该步骤不可省略)。

需自备的仪器和用品:

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织样本:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。

2.血清样本:直接测定。

3.细胞样本:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)加入提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心10min,取上清待测。二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,用蒸馏水调零。

2.操作表:在微量石英比色皿/96孔板中加入下列试剂


空白管测定管
样本(μL)-40
工作液(μL)9090
H2O(μL)11070
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃水浴或者培养箱3min(有控温功能的酶标仪可以设置唯独为37℃),拿出迅速擦干测定190s时的吸光值A2,计算ΔA测定管= A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)

三、CK活性计算

1.按微量石英比色皿计算

(1)按组织蛋白浓度计算:

酶活定义:37℃,pH7.0时,每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。

CK活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=268×ΔA÷Cpr

(2)按组织样本质量计算:

酶活定义:37℃,pH7.0时,每克样本每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。

CK活性(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×W)÷T=268×ΔA÷W

(3)按血清体积计算:

酶活定义:37℃,pH7.0时,每ml血清每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。

CK活性(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T=268×ΔA

(4)按细胞数量计算:

酶活定义:37℃,pH7.0时,每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。

CK活性(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=268×ΔA÷细胞数量

ε:NADpH的摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,2×10-4L;V样:反应体系中样本体积,0.04ml;V样总:提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g;细胞数量:以104为单位计算,万个;T:反应时间,3min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

2.按96孔UV板计算将上述公式中的d=1cm改为0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.血清的CK不稳定,采集样本后尽快测定,4℃避光保存可稳定24h。

2.样本蛋白质含量需要另外测定。

3.OD值大于0.6可用提取液适当稀释样本,并在计算公式中相应的改变稀释倍数。

4.ΔA空白管一般不超过0.01。

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