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谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成GS/GOGAT循环,参与氨同化的调控。

GOGAT以NADH为电子供体,催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸,NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一液体20ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×2支2-8℃
试剂三粉剂×2支2-8℃
试剂四粉剂×2支-20℃

溶液的配制:

工作液的配制:取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入10ml试剂一中溶解,现用现配,可分装后-20℃保存,避免反复冻融。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。

2.工作液提前配置,平衡至室温。

3.样本测定:

试剂名称(μL)测定管
工作液180
样本20
在微量石英比色皿或者 96孔 UV板中混匀,加样本的同时开始计时,在 340nm波长下记录 20秒时的初始吸光度 A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 25℃水浴或培养箱中准确反应 5分钟(若酶标仪带有控温功能,将温度调至 25℃);迅速取出比色皿并擦干,340nm下比色,记录 5分 20秒时的吸光度 A2,计算ΔA=A1-A2。

三、GOGAT活性计算

a.按微量石英比色皿计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(V样×Cpr)÷T=321.5×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.5×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.643×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol =109nmol。

b.按 96孔 UV板计算:

将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔 UV板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。

2.**两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3.当 A1大于 1.5或者ΔA大于 0.6(酶标仪ΔA大于 0.4)时,建议将样本用蒸馏水稀释后测定,当ΔA过小时,可以延长酶促反应时间(10min或 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。

4.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

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