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超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/48样


产品介绍

注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

SOD(EC 1.15.1.1)是一种广泛存在于生物体内的金属酶,是重要的氧自由基清除剂,能催化超氧化物阴离子发生岐化作用,生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶,也是H2O2主要生成酶,在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-),O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜,后者在560nm处有吸收;SOD可清除O2-,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深,说明SOD活性愈低,反之活性越高。

产品内容:

提取液:液体100ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体5ml×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体100μL×1支,4℃保存;使用前先离心再吹打混匀。

试剂三:液体4ml×1瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×1支,4℃保存。(由于试剂量极少,容易产生误差,现规格为0.0003g/支,使用时称取0.00003g即可。)

试剂五:液体2ml×1瓶,4℃保存;临用前将试剂四加入试剂五中,并震荡溶解。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样品的前处理:

(1)细菌、细胞或组织样品的制备:细胞、细菌样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液,超声波破碎(功率20%或200w,超声3s,间隔10s,重复30次)。8000g 4℃离心10分钟,取上清,置冰上待测。组织样本:称取约0.1g组织,加入1ml提取液进行冰浴匀浆; 8000g 4℃离心10分钟,取上清,置冰上待测。

(2)血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤:

1、分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至560nm,蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、三和五37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min以上。

3、样本测定(按顺序加入下列试剂)

试剂名称(μL)测定管对照管空白管1空白管2
样本1818--
试剂一45454545
试剂二2-2-
试剂三35353535
蒸馏水9092108110
试剂五10101010

充分混匀,37℃水浴30min后,560nm处测定各管吸光值A。计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA空白=A空1-A空2。如底部有沉淀,混匀后再行测定。

注意:

1、样本和试剂二使用时在冰上放置。

2、样本较多时,可按表格配置工作液(包含试剂一、二、三),试剂五必须最后加入。

3、空白管1和空白管2各只需做1~2管;每个样本有一个对照管。

4、反应完成后,可能有沉淀生成,混匀后测定即可。

三、SOD活性计算:

1、抑制百分率的计算

抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定)÷ΔA空白× 100%

尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内,越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样品;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样品。

2、SOD酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。

3、SOD酶活性计算:

(1)血清(浆)SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷( 1-抑制百分率)×V反总]÷V样×F=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率)×F

(2)组织、细菌或培养细胞SOD活力计算:

A:按样本蛋白浓度计算

SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr)×F=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率)÷Cpr×F

B:按样本鲜重计算

SOD活性 (U/g鲜重)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反总]÷(W×V样÷V样总)×F=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率)÷W×F

C:按细菌或细胞个数计算

SOD =活力 (U/104 cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(500×V样÷V样总)×F=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

V反总:反应体系总体积,0.2ml;V样:加入反应体系中样本的体积,0.018ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样品质量,g;500:细胞或细菌总数,500万,F:样本稀释倍数。

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