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γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
包装:50管/48样


产品介绍

γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。

γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体50ml×1瓶4℃
试剂一粉剂×1瓶4℃
试剂二液体12.5ml×1瓶4℃
试剂三液体44.5ml×1瓶4℃

溶液的配制:

工作液(在试剂一瓶中配制):临用前配制,把试剂二倒入试剂一瓶中,充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解);然后把试剂三倒入试剂一瓶中,混匀后室温保存。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);10000rpm 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.组织:称取约0.1g样本,加提取液1.0ml充分研磨,于4℃,10000rpm离心15min,取上清液待测。

3.血清(浆):直接检测。

二、测定步驟

1.分光光度计预热30min以上,调节波长至405nm,蒸馏水调零。

2.试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min以上(保证无沉淀)。

3.样本测定:

试剂(μL)空白管测定管
蒸馏水100-
上清液/血清-100
工作液900900

混匀后于405nm测定10s时的吸光度,吹打混匀后测量130s时的吸光度,记为A1和A2。计算ΔA测定管=A测2-A测1,ΔA空白管=A空2- A空1,计算ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。

三、γ-GT活性计算

1.按样本蛋白浓度计算:

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T=0.506×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算:

活性单位定义:25℃或者37℃中,每克组织每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=0.506×ΔA÷W

3.按血清(浆)体积计算:

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升血清每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷V样÷T=0.506×ΔA

4.按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(500×V样÷V提取)÷T=0.001×ΔA

V样:加入样本体积,0.1ml;V提取:加入提取液体积:1ml;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞数量,500万细胞;ε:对硝基苯胺消光系数,9870L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.001L;106:单位换算系数,1mol=106μmol。

注意事项:

培养细胞中γ-GT活性测定时,细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。

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