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糖原合成酶(GCS)试剂盒(紫外分光光度法)
货号:GCS-2-Y
包装:50管/48样


产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

GCS(EC 2.4.1.11)催化 UDPG和葡萄糖残基生成糖原和 UTP,以 α-1,4-糖苷键相连延长糖链,是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶,是胰岛素作用的主要靶酶,对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。

测定原理:

GCS催化 UDPG和葡萄糖残基生成糖原和 UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成 NAD+,在 340nm下测定 NADH下降速率,即可反映 GCS活性。需自备的仪器和用品:分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 18 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:液体 2.5mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:液体 16.4uL×1支,4℃保存;

试剂四:粉剂×1支, -20℃保存;

试剂五:粉剂×1支, -20℃保存;

样本的前处理:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂五的配制:临用前在试剂五中加入 1mL试剂二充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂五置于 37℃预热 5分钟。

5、在 1mL微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、10μL试剂五和 180μL工作液,立即混匀,记录 340nm处初始吸光值 A1和 1min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。注意:在该试剂盒中,若 ΔA大于 0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使 ΔA小于 0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

GCS活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3215×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。

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