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LOVO/5FU人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株
货号:iCell-0057a(STR(lovo
包装:1×106


产品介绍

细胞介绍

注:本培养基是不直接添加氟尿嘧啶药物的。

细胞特性

1)来源:结直肠腺癌

2)形态:上皮样贴壁生长

3)含量:>1x106细胞数

4)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装

5)用途:仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

(1)1mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。

(2)T25瓶复苏的存活细胞常温发货,收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1)收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们。

2)请在4或5X显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据。

3)贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4)备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后**次传代建议T25培养瓶1:2传代 。

一.培养基及培养冻存条件准备:

(1)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。

(2)完全培养基的配制:

①准备F12K(推荐iCell-0007) 培养基:优质胎牛血清,10%;双抗,1%;补充F12K基础培养基至所需体积。

②准备F12K含5-Fu完全培养基:优质胎牛血清,10%;双抗,1%;5-Fu:400~1065uM;补充F12K基础培养基至所需体积。

(3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

注意:

①细胞在传代和刚复苏时较为脆弱,中止液须为不含5-Fu的完全培养基,且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含5-Fu的完全培养基,待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加5-Fu。

②若细胞生长状态较为缓慢时,可适当降低5-Fu的浓度,或使用不含5-Fu的完全培养基培养至细胞生长状态较好时,再更换为所需的5-Fu浓度。

细胞培养

(1)细胞复苏

①将恒温水浴锅中的水预热到37℃;

②准备一支15ml离心管,加入5mL含10%FBS的完全培养基,放入37℃水浴锅中预热;

③戴上护目镜,厚毛线手套后,从液氮罐中取出要复苏的细胞,尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率;

④将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中,混匀后,1000rpm离心5min;

⑤准备一个T25培养瓶,写上细胞名称、日期,再加入4mL完全培养基;

⑥离心完成后弃去上清,用1mL完全培养基重悬细胞后,转入T25细胞培养中,混匀后转入CO2培养箱中培养静置。

注意:从液氮中取出细胞冻存管时,若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留的液氮,之后拧紧冻存管,置于干冰上,然后放入37℃水浴中,避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

(2)细胞传代

①当细胞汇合度达到85%以上时,可进行传代;

②在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基;

③向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS 后,水平放置培养瓶,使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃PBS;

④向瓶内加入消化液1mL(0.25%胰蛋白酶),浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育3~5min;

⑤孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10%FBS的完全培养基中,将悬液吸入15mL离心管;

注意:如还有部分细胞未消化下来,可采用分步消化:

a.准备一个无菌的15mL离心管,加入2mL含10%FBS的完全培养基;

b.将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打);

c.向之前消化的培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶继续消化2min左右,轻拍培养瓶,95%左右细胞脱落后加入2mL含10%FBS的完全培养基中和,中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

⑥1000rpm离心5min;

⑦准备两个新的T25培养瓶,各加入4mL完全培养基;

⑧离心完成后,弃上清,用2mL完全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入2个T25培养瓶,每个培养瓶各1mL;

⑨水平放置培养瓶,震荡混匀后将培养瓶置于37℃,5%CO2培养箱中静置培养。

(3)细胞冻存(注意:细胞冻存建议每瓶T25冻一支)

①~⑥请参照传代步骤;

⑦离完成后,弃上清,用1mL冻存液重悬细胞沉淀,然后转入1.8mL冻存管中;

⑧将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中,之后转入-80℃冰箱中过夜降温;

⑨第2天,取出降温完成的序降温盒中的冻存管,尽快转入液氮罐中保存。记录冻存管位置以便下次拿取。

细胞介绍

HCT-15/FU为由HCT-15细胞构建的耐5-FU药物细胞株。

细胞特性

1)来源:人结肠癌细胞耐药筛选

2)形态:上皮细胞样,贴壁生长

3)含量:>1×106细胞数

4)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装

5)用途:仅供科研使用。


细胞运输、保存及注意事项


复苏细胞

冻存细胞

包装

充液的T25细胞培养瓶

1mL冻存管

运输条件

常温

干冰

保存方式

37℃恒温细胞培养箱

-80℃冰箱中保存过夜后转入液氮

或立即复苏

※注意事项

1.收到细胞后,若发现培养瓶破损、漏液及细胞有污染;或冻存管有破损,融化、漏液等,请立即拍照并联系我们。照片包括细胞培养瓶/冻存管外观,显微镜下细胞照片(100倍,200倍各2张);

2.若收到的复苏细胞有少量细胞脱落、飘起,可能由于运输途中导致。请先于37℃恒温细胞培养箱中静置2~3h后,再进行处理;

3.复苏细胞的充液培养基为不含药物的维持培养基,血清浓度较低,收到细胞后请及时更换为完全培养基;

4.建议收到细胞后,首先进行扩增(至少3代),并冻存部分细胞以备用。

5.初次培养,当细胞汇合度达约80%时,可加入10~16ug/mL 5-FU的完全培养基培养至细胞完全融合后传代。细胞传代1~2次后仍能保持增殖,即可提高药物浓度至20ug/mL继续培养;若此过程中细胞停止增殖,且状态较差,则需降低药物浓度(**降低一半药物浓度)或使用不含药物的完全培养基培养,至细胞汇合度达80%左右,且生长状态较好时,再更换为所需的5-FU药物浓度。

6.细胞冻存过程中,不可添加药物,且冻存液中不含药物。

细胞培养试剂的配制

1)5-FU药物的配制及保存

建议将5-FU药物配制成20mg/mL的母液,即使用1mL 1M的NaOH溶液溶解20mg 5-FU药物,使其完全溶解。(若所购买的5-FU药物规格为10mg,则加入0.5mL 1M的NaOH溶液,待其完全溶解即为20mg/mL母液)

注意:可根据用量配置药物,并将药物分装保存,避免反复冻融导致药物失效。溶解后的5-FU,4℃保存1周,-20℃保存1个月,-80℃保存6个月。

2)冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO,现用现配。(冻存液中不含药物)

3)完全培养基的配制(推荐使用iCell-h073-001b)

成分

体积/浓度

优质胎牛血清

10%

双抗

1%

20ug/mL 5-FU

0.1%母液(20mg/mL)

RPMI-1640培养基

补充至所需体积

细胞培养条件

气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%~80%。

细胞处理

1)冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀,1000rpm/min离心3~5min,弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后,均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中,置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第2天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

注意:①细胞复苏过程中,不可使用含有药物的培养基。须在细胞生长至汇合度达80%左右时,方可添加10~16ug/mL 5-FU药物;若细胞生长状态较为缓慢,可适当降低5-FU的浓度(**降低一半药物浓度),或使用不含5-FU的完全培养基培养至细胞生长状态较好时,再更换为所需的5-FU浓度。

②建议复苏细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩,避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸,造成人员伤害。

2)细胞传代(建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1:2比例传代)

①待细胞密度达到80%~90%时,即可进行传代培养。

②弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次,吸净残余的PBS。

③加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化2~5min,显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落,即可轻拍培养瓶至细胞全部脱落。迅速拿回操作台,加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。

④将细胞悬液移入离心管中,1000rpm/min离心5min,弃去上清液。

⑤向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞,轻吹混匀。将细胞悬液按1:1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中,添加6~8mL完全培养基。

注意:细胞传代1~2次后仍能保持增殖,即可提高药物浓度至20ug/mL继续培养;若此过程中细胞停止增殖,且状态较差,则需降低药物浓度(**降低一半药物浓度)或使用不含药物的完全培养基培养,至细胞汇合度约80%,且生长状态较好时,再更换为所需的5-FU药物浓度。

3)细胞冻存

①细胞冻存时,步骤同2)细胞传代的①~④,细胞计数后,加入配制好的细胞冻存液,重悬细胞,按照1×106~ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。

注意:细胞冻存过程中,不可添加药物。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

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