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线粒体呼吸链复合物III检测试剂盒(辅酶Q-细胞色素C还原酶)(比色法)
货号:A089-3-1
参考价格:2790
包装:20管/10样


产品名称
Electron transport chain Complex III assay kit
线粒体呼吸链复合物III试剂盒(辅酶Q-细胞色素C还原酶)
产品介绍

检测原理:
       线粒体呼吸链复合物III,通常称为辅酶Q-细胞色素C还原酶、细胞色素还原酶或bc1复合物(ubiquinol cytochrome c oxidoreductase;cytochrome reductase;bc1 complex),是线粒体电子传递链的中心元素:含有十一个亚单位,包括细胞色素b(Cytochrome b),细胞色素c1(cytochrome c1)和Rieske铁硫蛋白(Rieske iron-sulfurprotein),通过Q循环(Q cycle)进行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的辅酶Q-细胞色素C还原酶。复合物III催化氧化型细胞色素C被还原为还原型细胞色素C,线粒体内电子由供体还原型泛醌(ubiquinol;UQH2)或还原型辅酶Q(reduced Coenzyme Q;CoQH2)传递到细胞色素C上的能量转移反应,进行呼吸链传递。该酶异常会导致心肌疾病。辅酶Q-细胞色素C还原酶反应系统测定氧化型细胞色素C的浓度变化。基于还原型泛醌或还原型辅酶Q底物,在抗霉素存在与否的情况下,通过辅酶Q-细胞色素C还原酶的催化,转化成泛醌(ubiquinone;UQ)或辅酶Q(Coenzyme Q;CoQ),同时氧化型细胞色素C,转化为还原型细胞色素C,在分光光度仪下产生吸光峰值的变化(550nm 波长),由此定量测定辅酶Q-细胞色素C还原酶的特异活性。其反应系统是:
                                                                            Complex III
                        CoQH2 + 2 ferricyt c3+ + 2H+-----------------> CoQ + 2 ferrocyt c2+ + 4H+
                                     ↓Abs 550 nm                                                        ↑Abs 550 nm

试剂组成:(20 管/10 样))
       缓冲液(Reagent A)     20 毫升
       反应液(Reagent B)     125 微升
       阴性液(Reagent C)     2 毫升
       底物液(Reagent D)     500 微升
       专性液(Reagent E)      200 微升
       稳定液 A(Reagent F1) 4 管
       稳定液 B(Reagent F2) 5 毫升
       产品说明书                      1 份

保存方式
        -20°C冰箱保存,避免反复冻融;反应液(Reagent B)和底物液(Reagent D),避免光照,有效期3个月。

用户自备
       比色皿:用于比色分析的容器
       双波长分光光度仪:用于比色分析
       培养箱:用于孵育反应物

实验步骤
       实验开始前,将-20°C冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;反应液(Reagent B)和底物液(Reagent D)注意避光。
      (一)、背景对照测定
1、移取 870 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 10 微升反应工作液
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、室温下静置 10 分钟,避免光照
5、加入 100 微升阴性液(Reagent C)
6、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7、即刻放入分光光度仪检测,此为背景空对照:
550 波长读数 1 分钟或 2 分钟-550 波长读数 0 分钟
      (二)、样品总活性测定
1、移取 870 微升 GENMED 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 10 微升 GENMED 反应工作液
3、加入 20 微升 GENMED 底物液(Reagent D)
4、室温下静置 10 分钟,避免光照
5、加入 100 微升待测样品(注意:15 微克总线粒体蛋白)
6、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7、即刻放入分光光度仪检测,此为样品总活性读数:
550 波长读数 1 分钟或 2 分钟-550 波长读数 0 分钟
      (三)、样品非特异活性测定
1、移取 850 微升 GENMED 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 10 微升 GENMED 反应工作液,避免光照
3、加入 20 微升 GENMED 底物液(Reagent D)
4、室温下静置 10 分钟,避免光照
5、加入 20 微升 GENMED 专性液(Reagent E)
6、加入 100 微升待测样品(注意:15 微克总线粒体蛋白)
7、上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
8、即刻放入分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:
550 波长读数 1 分钟或 2 分钟-550 波长读数 0 分钟

样品活性计算:
       (1)、样品活性(总活性或非特异活性)
            
                               单位:μmol CoQH2/min/mgprot

        (2)、样品特异活性
                                        样品总活性-样品非特异活性=样品特异活性

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